Программные продукты и системы

Введение. Практика анализа белков протеома биологических объектов показывает, что до настоящего времени исследования основывались в большей степени на универсальной технологии тандемной масс-спектрометрии  с жидкостной хроматографией [1]. В различных областях медико-биологических исследований спектрометрический анализ белков обычно решает две основные задачи: идентификацию наличия конкретных белков и их протеоформ, а также оценку их содержания в биологических и биоподобных образцах [2].

Наиболее распространенной стратегией при планировании и проведении экспериментов протеомного анализа является подход «снизу вверх», при котором извлеченные из образца белки подвергаются фрагментации на олигомеры (пептиды) с использованием расщепляющих ферментов или других физико-химических воздействий. Такой метод предполагает хроматографическое разделение и масс-спектро- метрические измерения, выполняемые на уров- не целых молекул белков или их крупных фрагментов [3, 4]. Получение данных масс-спектров пептидов может производиться в зависимом  и независимом от данных режимах. В первом – фрагментация ионов пептидов и получение масс-спектров второго порядка производится только для диапазонов отношения массы к заряду с наибольшей интенсивностью. Во втором, поддерживаемом современным оборудованием масс-спектрометрии высокого разрешения – производится фрагментация всех ионов, попадающих в предопределенные окна диапазона отношения массы к заряду (https://bigomics.ch/ blog/how-to-process-raw-mass-spectrometry-data- top-tools-for-proteomics-data/).

Инструментальный анализ и процедура обработки данных в задачах идентификации соста- ва и содержания белков в образцах при про- ведении медико-биологических исследований включают: получение данных тандемной масс-спектрометрии с жидкостной хроматографией пептидов (зависимое от данных или независи- мое); обнаружение спектральных пиков и извлечение признаков; идентификацию пептидов; оценку вероятности ошибочного определения; идентификацию белков по обнаруженным пептидам; количественную оценку содержания белков. Успешность проведения первого этапа целиком зависит от качества работы лаборатории и применяемого оборудования. Второй этап является хорошо разработанной областью обработки результатов жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии данных [5].

Идентификация пептидов по данным, генерируемым жидкостной хроматографией/масс-спектрометрией, является ключевым этапом, который определяет чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов протеомного анализа. Основными стратегиями идентификации состава пептидов в образце  и оценки их содержания являются использование белковых БД и определение аминокислотных последовательностей пептидов без априорной информации (de novo секвенирование пептидов).

Использование белковых БД значительно упрощает выполнение этапа протеомного анализа. Последовательности, хранящиеся в БД виртуально расщепляются и формируют набор пептидов для поиска пептид-спектральных соответствий (ПСС). Однако такой метод идентификации требует надежной гипотезы о составе белков, потенциально содержащихся в образце, и наличия качественно секвенированного протеома – множества аминокислотных последовательностей первичной структуры всех белков, которые могут быть обнаружены в процессе выполнения анализа. Известно большое количество программных средств, автоматически выполняющих идентификацию пептидов по данным жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии и референсному набору белков в БД, например, [6–8].

При отсутствии точной информации о представленных белках или при наличии существенных различий (например, эволюционных) между реальными белками в образце и теми, которые включены в состав референсного протеома для поиска, применяются средства de novo секвенирования пептидов. Программы реконструкции аминокислотной последовательности пептидов без использования предварительной информации о структуре белков исследуемого объекта используют широкий спектр алгоритмов – от базовых методов оптимизации и динамического программирования до систем глубокого обучения сложных архитектур [9]. Так, программы lutefisk, MSNovo, PEAKS [10] используют алгоритмы оптимизации на основе динамического программирования для получения аминокислотной последовательности, наи- лучшим образом соответствующей экспериментальному спектру ионов фрагментов.

С ростом интереса к интеллектуальным методам прогнозирования последовательностей пептидов для de novo секвенирования начали широко применяться технологии на основе алгоритмов глубокого обучения. Известно более 20 таких средств [11], многие из них имеют архитектуру сверточных нейронных сетей [12–14], рекуррентных сетей, таких как LSTM [15–17], и трансформеров [9, 18, https://github.com/insta- deepai/InstaNovo]. Эффективность средств de novo секвенирования пептидов оценивается  и сопоставляется по недостаточно описанным критериям. Поэтому качество работы и пригодность к решению задачи идентификации этих программ можно оценить только по публикациям коллективов их разработки.

Следовательно, существует потребность разработки единой методики и реализующего ее программного средства статистической оценки качества работы программ de novo секвени- рования пептидов, позволяющих выполнить сравнительный анализ на основе кортежа показателей ПСС с эталоном.

Постановка задачи de novo  секвенирования

Программные средства de novo секвенирования пептидов получают в качестве входных данных множество экспериментальных спектральных измерений, дополненных данными  о заряде, времени выхода из хроматографической колонки и экспериментально полученном отношении массы к заряду для иона-предшественника пептида:

S = {Si | i = 1, …, m},

где S – множество входных спектральных измерений; Si – кортеж конкретного i-го спектра (измерения); m – число измерений во входном наборе данных;

где Zi – заряд i-го иона-предшественника пептида; Rti – время выхода i-го пептида из хроматографической колонки; Mzei – экспериментальное отношение массы к заряду (m/z) i-го иона предшественника; MS2i – спектр фрагментации в виде ряда измерений пиков в коорди- натах отношений массы к заряду и интенсивности;

где m/zj и Ij – данные отношения массы к заряду и интенсивности j-го пика спектра фрагментации i-го иона-предшественника пептида.

По итогам работы программы реконструкции последовательности пептида методом de novo секвенирования для каждого спектра фраг- ментации может быть сформировано ПСС:

где PSM – множество выходных ПСС в результатах работы средства реконструкции последовательностей пептидов; PSMik – кортеж k-го ПСС, релевантного i-му входному спектральному измерению; p – количество ПСС в выходных данных программы de novo секвенирования;

где Pk – реконструированная аминокислотная последовательность с учетом химических посттрансляционных модификаций аминокислот, идентифицированная k-м ПСС для i-го спектрального измерения; Mzk – теоретическое отношение массы к заряду, соответствующее  заряду иона-предшественника пептида и моноизотопной молекулярной массе аминокислотной последовательности Pk.

Для большинства лабораторий, занимающихся идентификацией белков и оценкой их содержания в анализируемых образцах, подход к оценке применимости конкретных доступных программных средств de novo секвенирования на основе сформированных обучающих наборов данных [10] неприемлем. Необходимо разработать альтернативную методику, где  в качестве эталонного набора ПСС для оценки эффективности доступных программных средств de novo секвенирования пептидов могут быть использованы результаты работы классических конвейеров идентификации пептидов на основе поиска в БД для образцов, состав и содержание белков в которых известен.

Разработанная методика

В статье [19] была представлена авторская методика оценки точности результатов прогнозирования генов в нуклеотидных последовательностях на нуклеотидном, генном и экзон-интронной структуры уровнях. Для вычис- ления статистических показателей точности на них использовалась эталонная аннотация –  информация о расположении генов, экзонов  и интронов, полученная из достоверного источ- ника (значительно более точная, чем результат работы оцениваемых программ). Пользуясь об- щими рассуждениями по оценке качества работы средств прогнозирования генов на экзон-интронном уровне, оценку точности результатов работы средств de novo секвенирования пептидов целесообразно выполнить на основе аналогичных адаптированных метрик.

Все спектральные измерения получают признаки принадлежности к следующим классам:

– спектральное измерение имеет ПСС в эталонном наборе, AS – количество спектральных измерений, имеющих ПСС в эталонном наборе;

– спектральное измерение имеет ПСС в результатах работы тестируемой программы,  PS – количество спектральных измерений, имеющих ПСС в тестируемом наборе;

– корректное ПСС при совпадении аминокислотных последовательностей пептида в эталонном и тестируемом наборе для конкретного спектра, CS – число спектральных измерений, имеющих корректное ПСС в тестируемом на- боре.

Чувствительность (Sn) и специфичность (Sp) результатов тестируемого программного инструмента de novo секвенирования пептидов определяются отношениями

Sn = CS/АS, Sp = CS/PS.

Дополнительные метрики точности прогнозирования основываются на том, что часть некорректно распознанных пептидов из числа PS неточно соответствует последовательностям пептидов из числа AS, в то время как некоторые спрогнозированные из числа PS соответству- ют спектральным измерениям, для которых вообще нет ПСС в эталонном наборе, и являются неверными W (wrong). Часть ПСС из эталонного набора (из числа AS) соответствует спектральным измерениям, не имеющим ПСС в тестируемом наборе, и относится к пропущенным M (missing). Тогда доли пропущенных  MR (miss rate) и доли неверных ПСС WR (wrong rate) составляют

MR = M/AS, WR = W/PS.

Программная реализация

На основе показателей методики разработана программа, предназначенная для оценки качества предсказания пептидных последовательностей по масс-спектрам средствами de novo секвенирования пептидов.

Представим псевдокод программы:

1. Загрузить исходные масс-спектры из файла в формате mzML

2. Загрузить эталонные данные из файла в форате idXML

   a. Извлечь идентификаторы спектров и соответствующие им пептидные последовательности

3. Загрузить резульаты de novo секвенирования из файла:

   a. Если формат CSV InstaNovo — прочитать столбцы `scan_number` и `final_prediction`

   b. Если idXML — получить `spectrum_reference` и первую (наиболее значимую) последовательность

4. Создать словарь для хранения найденных эталонных последовательностей (search_sequences: ключ номер спектрального измерения, значение последовательность пептида)

5. Создать словарь для хранения предсказанных последовательностей (predicted_sequences: ключ номер спектрального измерения, значение последовательность пептида)

6. Для каждого спектра:

   a. Проверить, есть ли он в `search_sequences` и `predicted_sequences`

   b. Определить статус:

      - Найдено в эталоне + Предсказано — сравнить последовательности

      - Найдено в эталоне + Не предсказано — пропущено

      - Не найдено в эталоне — не учитывается

   c. Обновить метрики:

      - `correct_predictions`: если последовательность совпадает (с учетом неразличимости аминокислот лейцина  и изолейцина в масс-спектрометрическом измерении)

      - `missed_predictions`: если пептид есть в эталоне, но его не предсказали

      - `wrong_predictions`: если пептид предсказан, но он неверный

7. Вывести детальный отчет для каждого спектра:

   a. `spectrum_id`, `search`, `prediction`, `matching`, `search_sequence`, `predicted_sequence`

8. Вычислить и вывести статистические метрики:

   a. Чувствительность = correct_predictions / reference_sequences

   b. Точность = correct_predictions / predictions

   c. Доля пропущенных = missed_predictions / reference_sequences

   d. Доля ошибок = wrong_predictions / predictions

Результаты

В таблице и на рисунках 1 и 2 приведены результаты оценки чувствительности и специфич- ности распространенных программ de novo се- квенирования пептидов Novor [20] и PepNovo [21], а также наиболее динамично развивающегося и цитируемого проекта InstaNovo [9] на основе модели нейронной сети трансформера, которая транслирует спектральные пики фрагментов ионов в пептидные последовательности.

В качестве эталонного набора ПСС использованы результаты идентификации пептидов  в шести образцах с известной структурой метапротеома свободно доступными программами поиска ПСС в БД белков с помощью свободного конвейера SearchGui [22]. Полученныеоценки чувствительности и специфичности подтверждают публичные выводы о значительном превосходстве проекта InstaNovo доступ- ных программ de novo секвенирования пептидов на основе алгоритмов оптимизации.

Выводы

Обоснованная количественная оценка сравнения результатов работы различных алгоритмов и программных средств реконструкции аминокислотных последовательностей пептидов является важной задачей, позволяющей контролировать точность новых разрабатываемых программ и их применимость в медико-биологических исследованиях. Предложенные в работе показатели оценки точности работы программ de novo секвенирования пептидов  и разработанное на их основе программное средство позволяют решать эту задачу, используя в контролируемых экспериментах надежные данные идентификации ПСС.

Список литературы

1. Li S., Li Sh., Liu S., Ren Ya. Mass spectrometry-based solutions for single-cell proteomics. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2025, vol. 23, no. 1, art. qzaf012. doi: 10.1093/gpbjnl/qzaf012.
2. Athira R.T., Aravind G.B., Arun M., Aneesh E.M. Mass spectrometry-based proteomics in forensic investigations: a focused review of LC-MS applications. Egyptian J. of Forensic Sci., 2025, vol. 15, art. 75. doi: 10.1186/s41935-025-00484-8.
3. Roberts D.S., Loo J.A., Tsybin Y.O. et al. Top-down proteomics. Nature Reviews Methods Primers, 2024, vol. 4, art. 38. doi: 10.1038/s43586-024-00318-2.
4. Ahmed S., Altman J., Jones G. et al. Tear fluid proteomics: a comparative study of DIA and DDA mass spectrometry. JMSACL, 2025, vol. 38, pp. 26–36.
5. Yan B., Shi M., Cai S., Su Y., Chen R., Huang C., Chen D.D.Y. Data-driven tool for cross-run ion selection and peak-picking in quantitative proteomics with data-independent acquisition LC-MS/MS. Analytical Chemistry, 2023, vol. 95, no. 45, pp. 16558–16566. doi: 10.1021/acs.analchem.3c02689.
6. Eng J.K., McCormack A.L., Yates J.R. An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database. JASMS, 1994, vol. 5, no. 11, pp. 976–989. doi: 10.1016/1044-0305(94)80016-2.
7. Perkins D.N., Pappin D.J.C., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis, 1999, vol. 20, no. 18, pp. 3551–3567. doi: 10.1002/
   (SICI)1522-2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2.
8. Craig R., Beavis R.C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics, 2004, vol. 20, no. 9, pp. 1466–1467. doi: 10.1093/bioinformatics/bth092.
9. Eloff K., Kalogeropoulos K., Mabona A. et al. InstaNovo enables diffusion-powered de novo peptide sequencing in large-scale proteomics experiments. Nature Machine Intelligence, 2025, vol. 7, pp. 565–579. doi: 10.1038/s42256-025-01019-5.
10. Ma B., Zhang K., Hendrie C., Liang C., Li M., Doherty-Kirby A., Lajoie G. PEAKS: Powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2003, vol. 17, no. 20, pp. 2337–2342. doi: 10.1002/rcm.1196.
11. Bittremieux W., Ananth V., Fondrie W.E., Melendez C. et al. Deep learning methods for de novo peptide sequencing. ChemRxiv, 2024. URL: https://chemrxiv.org/doi/pdf/10.26434/chemrxiv-2024-l6wnt-v2 (дата обращения 13.06.2025). doi: 10.26434/chemrxiv-2024-l6wnt-v2.
12. Tran N.H., Zhang X., Xin L., Shan B., Li M. De novo peptide sequencing by deep learning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2017, vol. 114, no. 31, pp. 8247–8252. doi: 10.1073/pnas.1705691114.
13. Karunratanakul K., Tang H.-Y., Speicher D.W., Chuangsuwanich E., Sriswasdi S. Uncovering thousands of new peptides with sequence-mask-search hybrid de novo peptide sequencing framework. MCP, 2019, vol. 18, pp. 2478–2491. doi: 10.1074/mcp.TIR119.001656.
14. Qiao R., Tran N.H., Xin L., Chen X. et al. Computationally instrument-resolution-independent de Novo peptide sequencing for high-resolution devices. Nature Machine Intelligence, 2021, vol. 3, pp. 420–425. doi: 10.1038/s42256-021-00304-3.
15. Yang H., Chi H., Zeng W., Zhou W., He S. pNovo 3: Precise de novo peptide sequencing using a learning-to-rank framework. Bioinformatics, 2019, vol. 35, no. 14, pp. 83–90. doi: 10.1093/bioinformatics/btz366.
16. Zhou X., Zeng W.-F., Chi H., Luo Ch. et al. pDeep: Predicting MS/MS spectra of peptides with deep learning. Analytical Chemistry, 2017, vol. 89, no. 23, pp. 12690–12697. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02566.
17. Tran N.H., Qiao R., Xin L., Chen X. et al. Deep learning enables de novo peptide sequencing from data-independent-acquisition mass spectrometry. Nature Methods, 2019, vol. 16, pp. 63–66. doi: 10.1038/s41592-018-0260-3.
18. Yilmaz M., Fondrie W.E., Bittremieux W., Oh S., Noble W.S. De novo mass spectrometry peptide sequencing with a transformer model. Proc. 39th ICML, 2022, vol. 22, pp. 25514–25522.
19. Аржаев В.И., Скворцов А.В. Многоуровневая оценка точности средств прогнозирования функциональной структуры генетических последовательностей // Программные продукты и системы. 2025. Т. 38. № 3. С. 409–416. doi: 10.15827/0236-235X.151.409-416.
20. Ma B. Novor: Real-time peptide de Novo sequencing software. JASMS, 2025, vol. 26, no. 11, рр. 1885–1894. doi: 10.1007/s13361-015-1204-0.
21. Frank A., Pevzner P. PepNovo: De Novo peptide sequencing via probabilistic network modeling. Analytical Chemistry, 2005, vol. 77, no. 4, pp. 964–973. doi: 10.1021/ac048788h.
22. Barsnes H., Vaudel M. SearchGUI: A highly adaptable common interface for proteomics search and de Novo engines. J. of Proteome Research, 2018, vol 17, no. 7, pp. 2552–2555. doi: 10.1021/acs.jproteome.8b00175.

References

1. Li, S., Li, Sh., Liu, S., Ren, Ya. (2025) ‘Mass spectrometry-based solutions for single-cell proteomics’, Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 23(1), art. qzaf012. doi: 10.1093/gpbjnl/qzaf012.
2. Athira, R.T., Aravind, G.B., Arun, M., Aneesh, E.M. (2025) ‘Mass spectrometry-based proteomics in forensic investigations: a focused review of LC-MS applications’, Egyptian J. of Forensic Sci., 15, art. 75. doi: 10.1186/s41935-025-00484-8.
3. Roberts, D.S., Loo, J.A., Tsybin, Y.O. et al. (2024) ‘Top-down proteomics’, Nature Reviews Methods Primers, 4, art. 38. doi: 10.1038/s43586-024-00318-2.
4. Ahmed, S., Altman, J., Jones, G. et al. (2025) ‘Tear fluid proteomics: a comparative study of DIA and DDA mass spectrometry’, JMSACL, 38, pp. 26–36.
5. Yan, B., Shi, M., Cai, S., Su, Y., Chen, R., Huang, C., Chen, D.D.Y. (2023) ‘Data-driven tool for cross-run ion selection and peak-picking in quantitative proteomics with data-independent acquisition LC-MS/MS’, Analytical Chemistry, 95(45), pp. 16558–16566. doi: 10.1021/acs.analchem.3c02689.
6. Eng, J.K., McCormack, A.L., Yates, J.R. (1994) ‘An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database’, JASMS, 5(11), pp. 976–989. doi: 10.1016/1044-0305(94)80016-2.
7. Perkins, D.N., Pappin, D.J.C., Creasy, D.M., Cottrell, J.S. (1999) ‘Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data’, Electrophoresis, 20(18), pp. 3551–3567. doi: 10.1002/
   (SICI)1522-2683(19991201)20:18<3551::AID-ELPS3551>3.0.CO;2-2.
8. Craig, R., Beavis, R.C. (2004) ‘TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra’, Bioinformatics, 20(9), pp. 1466–1467. doi: 10.1093/bioinformatics/bth092.
9. Eloff, K., Kalogeropoulos, K., Mabona, A. et al. (2025) ‘InstaNovo enables diffusion-powered de novo peptide sequencing in large-scale proteomics experiments’, Nature Machine Intelligence, 7, pp. 565–579. doi: 10.1038/s42256-025-01019-5.
10. Ma, B., Zhang, K., Hendrie, C., Liang, C., Li, M., Doherty-Kirby, A., Lajoie, G. (2003) ‘PEAKS: Powerful soft-ware for peptide de novo sequencing by tandem mass spectrometry’, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 17(20), pp. 2337–2342. doi: 10.1002/rcm.1196.
11. Bittremieux, W., Ananth, V., Fondrie, W.E., Melendez, C. et al. (2024) ‘Deep learning methods for de novo peptide sequencing’, ChemRxiv, available at: https://chemrxiv.org/doi/pdf/10.26434/chemrxiv-2024-l6wnt-v2 (accessed June 13, 2025). doi: 10.26434/chemrxiv-2024-l6wnt-v2.
12. Tran, N.H., Zhang, X., Xin, L., Shan, B., Li, M. (2017) ‘De novo peptide sequencing by deep learning’, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 114(31), pp. 8247–8252. doi: 10.1073/pnas.1705691114.
13. Karunratanakul, K., Tang, H.-Y., Speicher, D.W., Chuangsuwanich, E., Sriswasdi, S. (2019) ‘Uncovering thousands of new peptides with sequence-mask-search hybrid de novo peptide sequencing framework’, MCP, 18, pp. 2478–2491.
    doi: 10.1074/mcp.TIR119.001656.
14. Qiao, R., Tran, N.H., Xin, L., Chen, X. et al. (2021) ‘Computationally instrument-resolution-independent de Novo peptide sequencing for high-resolution devices’, Nature Machine Intelligence, 3, pp. 420–425. doi: 10.1038/s42256-021-00304-3.
15. Yang, H., Chi, H., Zeng, W., Zhou, W., He, S. (2019) ‘pNovo 3: Precise de novo peptide sequencing using a learning-to-rank framework’, Bioinformatics, 35(14), pp. 83–90. doi: 10.1093/bioinformatics/btz366.
16. Zhou, X., Zeng, W.-F., Chi, H., Luo, Ch. et al. (2017) ‘pDeep: Predicting MS/MS spectra of peptides with deep learning’, Analytical Chemistry, 89(23), pp. 12690–12697. doi: 10.1021/acs.analchem.7b02566.
17. Tran, N.H., Qiao, R., Xin, L., Chen, X. et al. (2019) ‘Deep learning enables de novo peptide sequencing from data-independent-acquisition mass spectrometry’, Nature Methods, 16, pp. 63–66. doi: 10.1038/s41592-018-0260-3.
18. Yilmaz, M., Fondrie, W.E., Bittremieux, W., Oh, S., Noble, W.S. (2022) ‘De novo mass spectrometry peptide sequencing with a transformer model’, Proc. 39th ICML, 22, pp. 25514–25522.
19. Arzhaev, V.I., Skvortsov, А.V. (2025) ‘Multilevel accuracy assessment of prediction tools for a genetic sequence functional structure’, Software & Systems, 38(3), pp. 409–416 (in Russ.). doi: 10.15827/0236-235X.151.409-416.
20. Ma, B. (2025) ‘Novor: Real-time peptide de Novo sequencing software’, JASMS, 26(11), рр. 1885–1894. doi: 10.1007/s13361-015-1204-0.
21. Frank, A., Pevzner, P. (2005) ‘PepNovo: De Novo peptide sequencing via probabilistic network modeling’, Analytical Chemistry, 77(4), pp. 964–973. doi: 10.1021/ac048788h.
22. Barsnes, H., Vaudel, M. (2018) ‘SearchGUI: A highly adaptable common interface for proteomics search and de Novo engines’, J. of Proteome Research, 17(7), pp. 2552–2555. doi: 10.1021/acs.jproteome.8b00175.